ذرات شبه ویروس: نقش آن ها به عنوان نانو واکسن ها و نانوحامل های دارویی

ذرات شبه ویروسی (VLPs) ساختارهایی در مقیاس نانو هستند که از پروتئین‌های ویروسی مونتاژ شده تشکیل شده‌اند که فاقد مواد ژنتیکی ویروسی هستند و بنابراین غیرعفونی هستند. VLP ها نانومواد پراکنده ای هستند که می توانند در سیستم های مختلفی از جمله پستانداران، گیاهان، حشرات و باکتری ها تولید شوند. VLP ها را می توان به عنوان حامل برای تحویل مواد زیستی و نانویی مانند داروها، واکسن ها، نقاط کوانتومی و مواد تصویربرداری به دلیل حفره درون ساختارشان مورد بهره برداری قرار داد.

VLP ها ساختارهای ایکوسادرال یا میله ای شکل هستند که توسط خودآرایی پروتئین های ساختاری ویروسی ساخته می شوند. این ساختارهای نانوذراتی برای اولین بار در سال 1968 در سرم بیماران مبتلا به سندرم داون، لوسمی و هپاتیت شناسایی شدند. متعاقباً نشان داده شد که کپسید ویروس، پوشش و گاهی اوقات پروتئین‌های اصلی ویروسی می‌توانند ساختارهای VLP را تشکیل دهند. VLP ها را می توان به طور تجربی در آزمایشگاه با استفاده از پروتئین های ویروسی نوترکیب تولید کرد که در طیف وسیعی از سیستم های بیانی از جمله سلول های پروکاریوتی، مخمر، رده های سلولی حشرات، گیاهان و رده های سلولی پستانداران بیان می شوند.

در حالیکه VLP ها معمولاً با استفاده از پروتئین ها از یک نوع ویروس تولید می شوند، VLP های کایمریک نیز می توانند با مونتاژ پروتئین های ساختاری از ویروس های مختلف ایجاد شوند. پروتئین‌های ساختاری از ویروس‌ها، مانند ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV)، ویروس مرتبط با آدنو، ویروس هپاتیت B (HBV)، ویروس هپاتیت C (HCV) و باکتریوفاژها برای تولید VLP استفاده شده‌اند.

این ذرات دارای اندازه‌های متفاوتی هستند که بیشتر آن ها از 20 تا 200 نانومتر متغیر هستند. VLP ها ساختارهای بسیار سازمان یافته ای هستند و به دلیل هندسه زیربنایی خود، شبیه الگوهای ساختاری مرتبط با بیماری زا (PASP) هستند که می توانند به طور موثر توسط سلول ها و مولکول های سیستم ایمنی شناسایی شوند. VLP ها برای اهداف مختلفی استفاده می شوند. از آنجایی که آن ها حاوی یک حفره داخلی هستند، می توان از آن ها  برای تحویل مواد بیولوژیکی مختلف از جمله ژن ها، پپتیدها، پروتئین ها و داروهای کوچک استفاده نمود.

کاربرد گسترده VLP ها پتانسیل آن ها در واکسن شناسی است که در آن می توانند چندین مزیت را نسبت به رویکردهای واکسن مرسوم ارائه دهند. به دلیل اندازه و شکل آن ها که شبیه اندازه و شکل واقعی ویروس های بومی است، این ساختارها می توانند به طور موثر پاسخ های ایمنی را برانگیزند و در VLP های فاقد ژنوم ویروسی، پتانسیلی برای تکثیر در سلول های هدف وجود ندارد، که ایمنی بهبود یافته ای را به ویژه برای افراد دارای نقص ایمنی ارائه می دهد. چندین واکسن مبتنی بر VLP برای استفاده در کلینیک تایید شده‌اند و اکنون در مراحل مختلف آزمایش‌های بالینی با سایر واکسن‌ها به صورت تجاری در دسترس هستند.
 

تصویر: طبقه بندی ساختارهای مختلف VLP
 

تولید، خالص سازی و فرمولاسیون واکسن VLP

فرآیند تولید عمومی برای یک واکسن مبتنی بر VLP به طور کلی از سه بخش اصلی تشکیل شده است: (الف) پردازش بالادستی (تولید)، (ب) پردازش پایین دست (تصفیه) و (ج) فرمولاسیون. اولین قدم در تولید VLP، شبیه سازی ژن های ساختاری ویروسی مورد نظر است.

سپس، پروتئین‌های ساختاری ویروسی با قابلیت خودآرایی در سیستم‌های بیانی پروکاریوتی (باکتری، مخمر) یا یوکاریوتی (سلول باکولوویروس/حشره، سلول پستانداران و گیاه) بیان می‌شوند. پس از برداشت و تجزیه کردن سلول ها، برای اطمینان از حذف بقایای سلولی و دانه های آلوده یک مرحله شفاف سازی انجام می شود.

برای به دست آوردن VLP های دست نخورده و خالص تر، مراحل تصفیه بیشتر مانند کروماتوگرافی تبادل یونی و اولتراسانتریفیوژ مورد نیاز است. مرحله خالص سازی نهایی (پولیش)، برای حذف پروتئین های باقیمانده سلول میزبان و اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود. در آخرین مرحله از فرآیند تولید واکسن VLPs، فیلتراسیون و فرمولاسیون استریل انجام می شود تا در نهایت به محصولی ایمن، کارآمد و موثر دست یابیم.
 

تصویر: نمای کلی بیان، خالص سازی و فرمولاسیون واکسن مبتنی بر VLP.
 

واکسن های مبتنی بر VLP در برابر بیماری های عفونی نوظهور

تا به امروز 110 پروتئین ویروسی از 35 خانواده ویروسی نشان داده شده است که قادر به مونتاژ در VLP ها هستند. از این مطالعات، چندین واکسن مبتنی بر VLP برای استفاده انسانی، از جمله Recombivax HB و Engerix-B برای HBV، Gardasil، Cervarix، و Gardasil-9 برای HPV و Hecolin برای HEV مجوز استفاده بالینی دریافت کرده‌اند. چندین واکسن دیگر مبتنی بر VLP نیز در مراحل مختلف طراحی، تولید و تایید هستند.
 

واکسن مبتنی بر HBV VLP

HBV، ویروسی از خانواده Hepadnaviridae، عامل اصلی هپاتیت B است. عفونت HBV می تواند منجر به هپاتیت حاد و مزمن شود و عوارض و مرگ و میر را به میزان قابل توجهی افزایش دهد. برآوردهای اپیدمیولوژیک نشان می دهد که دو میلیارد نفر در جهان دارای ویژگی های سرولوژیکی عفونت هپاتیت B هستند که 350 میلیون نفر از آن ها به هپاتیت B مزمن مبتلا هستند. واکسیناسیون در حال حاضر موثرترین راه برای جلوگیری از HBV است.

سه نسل از واکسن های VLP علیه HBV ساخته شده است. اولین نسل از یک واکسن هماتوژن مبتنی بر HBV VLP که از آنتی ژن سطحی هپاتیت B (HBsAg) تشکیل شده بود، واکسن Heptavax-B بود که در بازار به عنوان واکسن Heptavax شناخته می شود. واکسن های نسل دوم HBV که به طور جداگانه توسط Merck و GlaxoSmithKline ساخته شده اند، یک واکسن مبتنی بر HBV VLP هستند که با مهندسی ژنتیکی ساخته شده اند.

هر دو شرکت از سیستم ساکارومایسس سرویزیه برای بیان HBsAg استفاده کردند و ذراتی با اندازه حدود 20 نانومتر با ساختار متقارن هشت ضلعی معمولی تولید کردند. این واکسن‌ها نسبت به نسل اول واکسن هپاتیت B که از خون مشتق می‌شود، ایمن‌تر و ایمنی‌زاتر هستند و امروزه به طور گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرند.

نسل سوم واکسن هپاتیت B به نام Sci-B-Vac، حاوی سه آنتی ژن HBV شامل آنتی ژن های S، Pre-S1 و Pre-S2 است و در سلول های CHO پستانداران بیان می شود.
 

واکسن مبتنی برHPV VLP

عفونت مداوم HPV عامل اصلی سرطان دهانه رحم و زگیل تناسلی است. در حال حاضر چهار واکسن پیشگیری کننده HPV بر اساس VLP های خود مونتاژ شده در بازار وجود دارد که فقط حاوی پروتئین L1 از جمله Gardasil (Merck)، Cervarix (GSK)، Gardasil-9 (Merck) و Cecolin (Innovax) هستند.

پروتئین L1 پروتئین ساختاری اصلی HPV است که می تواند در یک VLP که بسیار ایمنی زا است و قادر به ایجاد یک پاسخ ایمنی نوع خاص است، جمع آوری شود. تجزیه و تحلیل ساختاری نشان داد که هر HPV VLP حاوی 72 پنتامر L1 است.

از بین سه واکسن، Cervarix کمترین غلظت آنتی ژن را دارد اما ایمنی زایی بالایی نیز دارد و می تواند محافظت طولانی مدت در برابر سویه های HPV16 و HPV18 ایجاد کند. اخیراً واکسن نوترکیب HPV نوع 16/18 (Solulin) با استفاده از سیستم بیان اشریشیا کلی ساخته شده است.

این سیستم ایمنی و عملکرد قابل قبولی را در آزمایشات بالینی فاز 3 نشان داده است. پیشنهاد شده است که در پیشرفت‌های آینده از VLPها می‌توان برای بیان آنتی‌ژن‌های متعدد برای محافظت در برابر سویه‌های مختلف یک ویروس از طریق طراحی کایمریک استفاده کرد.
 

واکسن مبتنی برHEV VLP

هکولین، اولین واکسن مبتنی بر VLP برای HEV که در چین راه اندازی و تولید شد، مزایای قابل توجهی در پیشگیری از عفونت HEV نشان داده است. HEV باعث هپاتیت روده ای می شود که در سراسر جهان رخ می دهد و همچنین ممکن است باعث هپاتیت حاد شدید پراکنده و اپیدمی شود. Hecolin VLP اندازه ای 20 تا 30 نانومتری دارد و از نسخه کوتاه شده pORF2 (اسید آمینه 368-606) به نام p239 تولید می شود. آزمایش‌های بالینی نشان داده‌اند که هکولین می‌تواند تیتر بالایی از آنتی‌بادی‌های HEV را برای محافظت در برابر عفونت القا کند.

توانسته است عفونت هپاتیت E را تا 93 درصد در 4.5 سال کاهش دهد. این در حال حاضر تنها واکسنی است که می تواند به طور موثر از عفونت هپاتیت E جلوگیری کند. از آنجایی که هکولین با استفاده از سیستم بیان E. coli تولید می شود، هزینه های تولید واکسن به شدت کاهش می یابد و بنابراین می تواند برای واکسیناسیون در کشورهای در حال توسعه مفید باشد.
 

واکسن مبتنی بر HIV VLP

HIV VLP ها با استفاده از پلتفرم های بیان مختلف تولید شده اند. HIV VLP های تشکیل شده از پروتئین های ساختاری p17 و p24 و تولید شده توسط مخمر اکنون به آزمایشات بالینی رسیده اند. چندین رده سلولی پستانداران برای تولید VLP های HIV بر اساس گلیکوپروتئین های Gag و/یا پوششی (env) با استفاده از ترانسفکشن موقت یا رده های سلولی ترانسفکت شده پایدار استفاده شده است. سیستم‌های باکولوویروس و سلول‌های حشره‌ای که به طور پایدار پروتئین‌های HIV را بیان می‌کنند نیز برای تولید VLPs gag-env استفاده شده‌اند.
 

واکسن مبتنی بر Paramyxovirus VLP

VLP های پارامیکسوویروس را می توان به دنبال بیان همزمان ماتریکس ویروسی و گلیکوپروتئین ها جمع آوری کرد. VLP های ویروس Nipah را می توان در سلول های HEK293T تشکیل داد که گلیکوپروتئین پیوسته ویروس (G)، گلیکوپروتئین فیوژن (F) و پروتئین ماتریکس (M) را بیان می کند. موش‌های واکسینه‌شده با NiP VLP آنتی‌بادی‌های اختصاصی علیه NiV تولید می‌کنند و همچنین پاسخ سلول‌های T CD8+ را قوی می‌کنند.

آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده نیز در خوک‌هایی که با NiP VLP واکسینه شده‌اند مشاهده شده است، اما در این حیوانات هیچ پاسخ سلولی CD8+ T مشاهده نشد. VLP های تولید شده با استفاده از پروتئین های سایر پارامیکسو ویروس ها مانند RSV توسعه یافته اند و نتایج امیدوارکننده ای را در مطالعات اولیه پیش بالینی نشان داده اند.
 

واکسن مبتنی بر VLP ویروس کرونا

چندین ویروس کرونای حیوانی منجر به بیماری های جدی در انسان شده است. اینها شامل MERS-CoV، SARS-CoV-1 و اخیراً SARS-CoV-2 که منجر به یک بیماری همه گیر جهانی شده است. ذرات ویروس کرونا از 4 پروتئین ساختاری از جمله پروتئین اسپایک (S)، پروتئین پوششی (E)، پروتئین غشایی (M) و نوکلئوپروتئین (N) تشکیل شده اند. آزمایش‌ها بر روی VLPهای SARS-CoV-1 نشان داد که بیان پروتئین‌های SARS-CoV-1 M و E در یک BVES یک VLP صاف و بدون سنبله ایجاد می‌کند در حالی که بیان همزمان M، E و S ساختاری را ایجاد می‌کند که شبیه SARS بومی است. نتایج مذکور باید از نظر توانایی محافظتی ارزیابی شوند.
 

VLP ها برای واکسیناسیون علیه سرطان

یک پاسخ ایمنی قوی با واسطه لنفوسیت T سیتوتوکسیک (CTL) یک عامل اصلی در ریشه کن کردن سلول های تومور است و توانایی VLP ها برای القای این پاسخ ها با رساندن آنتی ژن به سیتوزول و فعال کردن مسیر MHC کلاس I، آن ها را به کاندیدای عالی برای توسعه واکسن تبدیل می کند.
 

واکسن های مبتنی بر VLP علیه سرطان دهانه رحم

برخی از عفونت های ویروسی می توانند منجر به سرطان شوند. به عنوان مثال، HPV یکی از این ویروس هاست، به ویژه دو نوع HPV16 و HPV18 که باعث 70 درصد موارد سرطان دهانه رحم می شود. این ویروس همچنین باعث سرطان های دیگری مانند مقعد، سر و گلو و زگیل تناسلی می شود. کپسید HPV از دو پروتئین مهم به نام‌های L1 (مژور) و L2 (مینور) تشکیل شده است. دو واکسن تجاری Merck's Gardasil و GlaxoSmithKline's Cervarix برای پیشگیری از سرطان مرتبط با HPV ساخته شده اند.

با این حال، این دو واکسن فقط می توانند از سرطان مرتبط با ژنوتیپ های 16 و 18 جلوگیری کنند و در برابر سایر ژنوتیپ های HPV محافظت نمی کند. در ضمن این واکسن های پیشگیرانه افراد مبتلا را درمان نمی کنند. بنابراین، محققان همچنان در تلاش برای تولید واکسن کارآمدتر هستند.

مشاهده شده است که دو آنتی ژن اختصاصی تومور به نام‌های E6 و E7 در تمام سلول‌های آلوده به HPV بیان می‌شوند و در سلول‌های تومور دهانه رحم افزایش می‌یابند. بنابراین، این دو پروتئین، دو پروتئین مهم سرکوبگر تومور را سرکوب می کنند. واکسن های مبتنی بر HPV VLP عمدتاً مبتنی بر L1 هستند زیرا این پروتئین می تواند VLP را تشکیل دهد. اما از آنجایی که L1 بین انواع مختلف HPV حفظ نمی شود، محققان بر توسعه واکسن مبتنی بر L2 نیز تمرکز کرده اند. با این حال، چالش L2 ناتوانی آن در تشکیل VLP است.
 

واکسن های مبتنی بر VLP علیه سرطان سینه

سرطان سینه شایع ترین سرطان در زنان است و مردان را نیز درگیر می کند. تا 30 درصد موارد سرطان سینه مهاجم با بیان بیش از حد گیرنده 2 فاکتور رشد اپیدرمی انسانی (HER2) مرتبط است که در تکثیر و مهار مرگ برنامه ریزی شده سلولی نقش دارد. القای ایمنی زایی غیرفعال با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال در جلوگیری از متاستاز و رشد تومور موثر بوده است، اما این روش پرهزینه است، برای محافظت طولانی مدت نیاز به تجویزهای متعدد در فواصل منظم دارد و عوارض جانبی نامطلوبی دارد.

نشان داده شده است که واکسن های مبتنی بر VLP این چالش ها را برطرف می کنند. واکسیناسیون فعال با یک واکسن مبتنی بر VLP مشتق شده از پروتئین پوششی AP205 فاژ اسینتوباکتر، با پروتئین HER2 نمایش داده شده در سطح، در موش‌های FVB که با سلول‌های سرطان پستان HER2 انسانی پیوند شده بودند، ارزیابی شد. این نشان داد که واکسیناسیون قادر به مهار رشد تومور در موش ها بود.
 

کاربرد VLPs در دارورسانی

اگرچه VLP ها بیشتر به دلیل خواص ایمنی زایی خود شناخته شده اند، اما اخیراً سایر قابلیت های این نانوذرات از جمله کاربرد آن ها در دارورسانی و ژن درمانی مورد توجه قرار گرفته است. سلول ها از اندوسیتوز با واسطه گیرنده برای جذب VLP ها استفاده می کنند. در طول اندوسیتوز، غشای پلاسمایی VLP ها را احاطه کرده و در داخل سلول به صورت وزیکول جوانه می زند. سپس وزیکول از غشا جدا شده و وارد سیتوزول می شود.

وزیکول های آزاد شده در امتداد اسکلت سلولی منتقل می شوند تا با اندوزوم های اولیه ترکیب شوند. در نهایت، وزیکول های اندوزومی از آندوزوم اولیه جدا می شوند، به عنوان اندوزوم نهایی بالغ می شوند و با وزیکول های پیش لیزوزومی حاوی هیدرولاز اسیدی ادغام می شوند و لیزوزوم ها را تشکیل می دهند. مواد خارجی در داخل لیزوزوم ها تجزیه شده و در دسترس سلول ها قرار می گیرند. تاکنون نانوحامل های متعددی با استفاده از روش های مختلف ساخته شده اند.

در میان نانوحامل‌ها، VLPها به دلیل توانایی آن ها در فرار از اندوزوم‌ها قبل از تجزیه لیزوزومی، برای اهداف دارورسانی بسیار مناسب هستند. تحویل مواد با استفاده از این نانوذرات می‌تواند دارورسانی هدفمند و درون سلولی را فراهم کند، تجمع و فراهمی زیستی دارو را در مکان‌های خاص، به عنوان مثال، بافت‌های تومور افزایش دهد، دوز مورد نیاز دارو را به حداقل برساند و نتایج درمان را بهبود بخشد. برخی از VLP ها یک حرکت طبیعی نسبت به بافت خاصی نشان می دهند که به دلیل ویروسی است که از آن منشاء گرفته اند.

به عنوان مثال، از آنجا که HBV به طور طبیعی کبد را آلوده می کند، VLP های مشتق شده از HBV می توانند سلول های کبد را هدف قرار دهند. به طور مشابه، روتا ویروس ها تمایل خاصی به روده نشان می دهند، به طوری که این ویژگی VLP های مشتق شده از آنها می تواند برای تحویل هدفمند دارو به بافت روده استفاده شود. هدف گذاری خاص تر معمولاً با نمایش دامنه اتصال گیرنده بر روی سطح VLP به دست می آید. دامنه های هدف می توانند از نظر شیمیایی یا ژنتیکی به سطح VLP ها متصل شوند، که به VLP ها اجازه می دهد به طور انتخابی به سلول های سرطانی که گیرنده خاصی را بیان می کنند متصل شوند و اثرات درمانی داروها را افزایش دهند.
 

 
منبع: ساقی نورایی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری